Betöltés...

ITT a jövő:

aGenom

Genomikai alapfogalmak & Módszerek

Genomunk műküdésének megértéséhez alapvető fogalmak ismertetése, illetve a diagnosztika és génterápiás eljárások módszertani bemutatása

Hogyan működik

aGenom

Rendszerbiológiai megközelítésben

A humán genom

Az élet molekulája, a dezoxiribonukleinsav (DNS), az egyik legstabilabb molekula, féléletideje megközelítőleg 521 év. Minden sejt működését irányító stabil kódrendszer, amely generációról generációra átadódik, folyamatos fejlődésre képes szenzációs egység. A genom magába foglalja a teljes DNS készletet, azaz tartalmazza mindazon információt, amely szükséges a szervezet felépítéséhez és fenntartásához.

23 pár kromoszóma

A képen látható a sejtmagban elhelyezkedő 23 pár kromoszóma leghűbb és aktualizált modellje, melyet Steven és mtsai publikált 2017.03.13-án a Nature újságban (doi:10.1038/nature21429).

Humán Genom Projekt

1990-ben indult az emberiség egyik legnagyobb méretű orvosbiológiai kutatása. A projekt célja a humán genom szekvenciájának a feltárása volt. 2001. február 15-én a Nature és Science folyóiratokban közölték az eredményeket, majd 2003. április 14.-én befejezettnek minősítették.

Funkcionális genomika szintjei

Dezoxiribonukleinsav, azaz DNS szintje

Minden ember, minden magvas sejtjében megtalálható a DNS. Két ember DNS-e 99,5%-ban azonos, ami azt jelenti, hogy átlagosan 15 millió bázispár különbség kölcsönzi a genom szintű egyediséget két ember között.

Ribonukleinsav, azaz RNS szintje

A DNS-ről átíródó RNS molekulák összességét transzkriptomnak nevezzük. A transzkriptomnak döntően két fontos szerepe van: templátként szolgálnak a fehérjék szintéziséhez (mRNS molekulák), illetve szabályozó és kulcsfontosságú szereppel bírnak a különböző sejtben zajló folyamatokban (rRNS, tRNS, miRNS, lncRNS, siRNS)

Fehérjék szintje

A sejtek citoplazmájában az érett mRNS molekulákból a transzlációs folyamat során fehérjék szintetizálódnak. A humán setekben leírt fehérjék száma 73112 (2018. 07. 26. adatok/ uniprot.org)

Metabolitok szintje

A humán metabolom nemzetközi adatbázisa szerint (4. verzió, 2018. 07. 26./ hmdb.ca) 114100 metabolitot azonosítottak a humán szervezetben.

3257347282

bázispár/ Humán genom (haploid)
GRCh38.p12

21360

Fehérjét kódoló humán gén
(2018 07 25)

11483

Betegség-asszociált humán gén
(2018 07 25)

38
trillió

Sejt az emberi szervezetben

Bevezető a genomika világába

Az ember legalapvetőbb biológiai meghatározója az egyes sejtjeiben található örökítőanyag. A korszerű nézet egyértelműen alátámasztani hívatott az örökítőanyag képlékenységét. Az idő- és térdimenzió hatása igen nagy jelentőséggel befolyásolja a bennünk élő örökítőanyag szerkezetét és funkcionalitását. Ezen szorosan szabályozott rendszer működési protokollját a környezeti tényezők felülírhatják és olykor felül is írják. A létrejövő igen komplex interakció eredményeként alakul ki a fenotípus: az egészséges szervezet vagy bölcsőjét veszi egy kóros folyamatlánc, mely végsősoron gyakran életminőségcsökkentő betegséget eredményez. A genom működésének legújabb tudományos alapokon nyugvó elméletének izgalmas felderítő kalandjára hívom meg Önt. Mielőtt belevághatnánk a sejtvezérlő élő molekulaközpontba, tekintsük át azokat a fogalmakat, amelyek biztosítják közös utazásunk során a közös nyelvet - a gördülékeny úthoz szükséges mankók - a bennünk rejlő csodálatos örökítőanyag megismeréséhez.
A genomika fogalmát megelőző és hosszú évtizedeken át domináló fogalom az öröklődéstan homlokterében a genetika volt. 1906-ban William Bateson a III. Londoni Növényhibridizációs konferencián vezette be a genetika fogalmát. Míg a genetika az egyes génekhez vagy dezoxiribonukleinsav (DNS) szakaszokhoz köthető funkciókat vizsgálja, a genomika a teljes genom szintjén, hálózatban próbálja értelmezni, átláthatóan örökítőanyagunk sorsmeghatározó voltát. Az 1930-as évek során született a genom, mint fogalom, a gén és kromoszóma szavak keverékeként. A genom jelentése az egy-sejtben található, fajra jellemző, DNS mennyiség, melynek szerves részét képezik a gének. A gén időszerű meghatározása, pedig a DNS egy olyan funkcionális szakasza, amelyről ribonukleinsav (RNS) molekula íródhat át. A humán sejtekben 23 pár DNS molekula található, melyek a sejtosztódási folyamathoz szükséges erős feltekeredésen (úgynevezett kondenzálódáson) esnek át, kromoszómákat (festődő testecskék) alkotva. A 2000-es éveket követően a tudományos világban robbanásszerű eredmények kapcsán megszületett a funkcionális genomika fogalma. A funkcionális genomika egy átfogó fogalom, amely magába foglalja a genom és a genomról folyamatosan képződő (RNS-re átíródó és fehérjékre szintetizálódó, azaz transzlálódó) molekulák összjátékát, melyek meghatározzák a sejtélettani folyamatokat. A genomról képződő összes RNS molekulák mennyiségét nevezzük transzkriptomnak. További részfogalma a funkcionális genomikának a hiszton kód. A DNS molekulák szinte kizárólagosan, valamilyen szinten felcsavarodott állapotban vannak. Ezen állapot kulcsszereplői a hiszton fehérjék, amelyek a genom működésének egyik fő szabályozórendszerét képezik. A hiszton kód a teljes hiszton fehérjemintázat egyes specifikus kémiai módosításainak a jellemzését foglalja magában. Végül, de nem utolsó sorban a DNS metilációs kód a DNS molekulák speciális szakaszain kialakult metilációs csoportok mintázatának meghatározását jelenti. A funkcionális genomikához tartozik részben az epigenomika. Szó szerint az epigenomika a „genom felettit” jelenti. Mindazon környezeti faktorokat vizsgáló tudományág amelyek a genom működését, annak DNS szekvencia módosítása nélkül, megváltoztatja. Következetésképpen a DNS metilációs kód és a hiszton kód az epigenomika két alappillérét alkotja. 2009-ben Tang és mtsai publikálták a világ első egy-sejt transzkriptomikás módszertant. 2012-ben Jinek és mtsai felfedezték, hogy a Streptococcus pyogenes baktérium bakteriális immunrendszeréhez tartozó (II-es típusú CRISPR-Cas rendszer) felhasználható génsebészeti eljárásként, amely igen meghatározó mérföldkőnek számít a tudományterületen. A tudományterület legifjabb ága, amely lehetővé teszi a genom, epigenom, transzkriptomika és proteomika egyidejű vizsgálatát, az egy-sejt funkcionális genomika 2017 második felében fejlődött alkalmazható módszertanná. Egy átláthatóbb, genetikai logikai szálakat összefűző útvonaltérképezést jelent egy-sejt szintű funkcionális genomika.

Genomikai alapfogalmak

Genomikai Nevezéktan



Genomikai és génsebészeti módszertan

DNA-PAINT

A DNS-PAINT (DNA-based Point Accumulation for Imaging in Nanoscale Technology) technika

TALEN alapú génszerkesztés

A TALEN (Transcription Activator-Like Effector Nucleases) már az 1990-es évek óta elérhető

ZFN alapú génszerkesztés

A Zink ujj nukleázok, ZFN (Zinc Finger Nucleases), olyan mesterségesen előállított endonukláz enzimek, amelyek tetszőleges DNS szekevnciát céloznak meg. Felhasználva a sejt saját, endogén DNS hibajavító apparátusát lehetőséget nyújt precíz genomszerkesztéshez a ZFN módszer.

CRISPR-Cas9 alapú genomszerkesztés

A CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Cas9 rendszer 2012 óta alkalmazható génsebészeti eljárás, amely segítségével precíz célzott változást lehet létrehozni a sejtek nukleáris genomjába. A rendszer egyedi előnye az ún. multiplex genomsebészet lehetősége, amellyel egy időben több célgén is megváltoztatható. A rendszer alkalmazása óta folyamatos fejlesztéseket dolgoznak ki egy még hatékonyabb génszerkesztés érdekében: 1. Olyan Cas9 variánsok alkalmazása, amelyek csökkentik az ún. off target hatást (precizitást növelő javítás) 2. Egy adott gén transzkripciós aktiválása (CRISPRa) 3. Egy adott gén transzkripciós csendesítése (CRISPRi). A CRISPR-Cas9 rendszer segítségével inaktiválhatunk (kikapcsolhatunk) géneket, új gén(változatokat) adhatunk a genomhoz vagy génexpressziót fokozhatunk (bekapcsolhatunk) amely potenciálisan az embert érintő számos betegség végleges gyógyításának igéretét hordozza magában.

Humán génterápiás eljárások

A génterápiás eljárások és a genomsebészeti módszerek közötti lényeges különbség az, hogy a nukleáris genomban a génterápia nem indukál stabil és szabályozott módosítást. Génterápia során genetikai anyagot jutattunk be a sejtekbe, amelyek vagy egy vad-típusú génkópiával pótolnak egy homozigóta funkcióvesztéses (loss-of-function, LOF) recesszív mutációt a szenvedő páciensben vagy csendesítenek egy funkciónyeréses (gain-of-function, GOF) domináns mutációt a páciensben. A sejtekbe bejutatott genetikai anyag amennyiben DNS, akkor a sejtmagba kerülve leggyakrabban a nukleáris genom mellett, ún. stabil episzomális, genom integráció nélkül fejti ki kedvező hatását. Az RNS alapú génterápiák célpontja a citoplazma, ahol a betegséget okozó génmutáció génexpressziójára fejthetik ki kedvező hatásuk.

Pregenomiális éra, azaz öröklődéstan 2001 előtt


Az emberiség történelemkönyvét lapozgatva számos olyan utalást és észrevételt olvashatunk, bizonyos élettani jelenségekről, amelyek az öröklődéstant, mint tudományág bölcsőjét alapozták meg. Már az ókorban is megfigyelték, hogy fontos a lovak tenyésztésében a kanca tulajdonságait nyomonkövetni. Hasonlóképpen számos háziállat esetében is erre vontakozó megfigyelésekkel találkozhatunk. De nemcsak az állatok esetében, hanem a növénynemesítés kapcsán is alkalmazták a különböző észrevételeket, például a vetőmagnak szánt gabona válogatási szempontja volt, hogy minél nagyobb legyen. Hippokratész szerint az egyes tulajdonságok öröklődnek, az utódok a szülőktől öröklik, ezzel szemben Arisztotelész úgy vélte az utódok távolabbi őseikre hasonlítanak. Először a 18. században növényekkel kísérletezett, növény hibridekkel foglakozott Kölreuter (1761-1766 között). Az első emberi betegség örökletességére született megfigyelés 1752-ben történt: Maupertuis megfigyelte a polydaktylia domináns öröklődését.

Gróf Festetics Imre (1764-1847) volt az első ember aki először használta a "genetika" fogalmat egy tudományos cikkben (Die genetische Gesätze der Natur. Oekonomische Neuigkeiten und Verhandlungen,1819) a világon, ezzel megelőzve a genetika, mint tudományágnak hivatalosan elfogadott névadóját William Batesont 80 évvel. Festetics elsőként utalt a "természet genetikai tövényeire". Megfogalmazta Mendel II. törvényét, illetve a mutáció alapelvét.

Gróf Festetics Imre

Továbbá 1820-ban Nasse megállapította, hogy a vérzékenység anyáról a fiú utódra öröklődik. A genetika atyjának tekintett Johann Gregor Mendel növényi hibridekkel kísérletezett, ám kísérletei eltértek elődjeitől, mivel pontos statisztikai mérésekkel értékelte kapott eredményeit. Mendel számos növényfajjal kísérletezett, ám az 1866-ban publikált dolgozatában a zöldborsóval végzett kísérleti eredményeit foglalta össze.A mendeli törvények, mind igazak azon gének öröklődésére, amelyek egymástól függetlenül öröklődnek: vagy különböző kromoszómákon helyezkednek el, vagy ugyanazon kromoszómán, de lényeges távolságra egymástól. Mendel munkásságának jelentőségére a XX. századig nem került sor.

1875-ben Ernst Haeckel először állította, hogy az öröklődésben a sejtmag fontos szerepet játszik. 1875-Herwig, 1879-Fol a tengeri sün peték fertilizációja kapcsán igazolták, hogy osztódáskor elengedhetetlen a sejtmag. Később Hammerling kísérletei bizonyítják a sejtmag jelentőségét az acetabularia moszatokon.

1888-ban megfigyelik a kromoszómákat mitózisban és meiózisban, majd Waldeyer nevezi el őket kromoszómának (festődő testecske). Francis Galton 1889-ben összegzi munkáját, a genetikai elképzeléseiról. Galton megpróbálta bizonyítani, hogy a tehetség öröklődik (1869- Örökletes tehetség). Egy és kétpetéjű ikekvizsgálattal tesztelte hipotézislt a környezet hatásának felmérésére bizonyos kvantitatív tulajdonságok kialakításában. Ugyanebben az évben Altman bevezeti a nukleinsav fogalmát. 1900-at írunk abban az évben, amikor DeVries „újra felfedezi” Mendel törvényeit. Ez évben Correns is hasonló eredményekhez jut. A harmadik, aki szintén ugyanezen eredményeket kapta az Tschermak volt. Ezen munkák fényt derítettek Mendel munkásságának értékére. 1901-ben DeVries felismeri, hogy a gének megváltozhatnak, és elnevezi a jelenséget mutációnak. 1902-ben Boveri közölte tanulmányát mely szerint az egészséges embrió fejlődéséhez minden kromoszómára szükség van, mivel mindegyikük egyedi információt tartalmaz. McCluy felfedezi a szex kromoszómákat. William Bateson 1902-ben igazolta először Mendel törvényeinek érvényességét állatokon. 1906-ban a 3. növényhibridizációs konferencián, Londonban Bateson javasolja először e tudományág nevének a genetikát, mely az örökletesség és a változékonyságot tanulmányozza. 1909-ben Garrod az alkaptonuria, Farabee és Castle az albinizmus recesszív öröklődését mutatták ki.

1910-ben Thomas Morgan ecetmuslicákon végzett kísérletei meghatározóak voltak a genetika, mint különálló tudományág fejlődésében. E kísérletek az öröklődés kromoszómális elméletét bizonyítják, mely szerint a gének a kromoszómákon helyezkednek el. 1924-ben Bernstein leírja a vércsoportok genetikáját. 1927-ben Müller ecetmuslicákkal végzett kísérleteivel a spontán mutációk gyakoriságát bizonyítja és kimutatja az indukált röntgen mutációkat. 1928-ban kísértletekkel azonosítják és leírjék az eukromatin/ heterokromatin fogalmat. 1933-ban Haldene, Hogben és Fischer kidolgozza a Pedigree módszert (családfanalízis). 1941-ben Auerbach és Robson (1943 Oehlers) megfigyelik bizonyos kémiai vegyületek mutáció indukáló hatását. 1941-ben Beade és Tatum bizonyítják a neurospóra gombával azt az elméletet amely szerint 1 gén 1 enzimet kódol (később ezen elmélet megbukik). 1944-ben Avery, MacLeod és McCarty baktériumokkal végzett elegáns kísérletekkel bizonyítják, hogy a DNS az örökítő anyag. 1949-ben létrehozzák a Humán Genetika Amerikai Társaságát és az első humángenetikai újságot: Amerikai Humán Genetika Hírlap. Megjelenik az első humángenetikai könyv: Curt Stern, A humán genetika elvei.

1953-ban James Watson, Francis Crick és Rosalind Franklin leírják a DNS dupla hélix szerkezetét, melyet két komplementer szál alkot, dezoxiribóz és monofoszfát molekulákkal. Wilson és Franklin megépítették a DNS modellt. 1955-ben Sanger meghatározta az aminosav szekvenciáját az inzulinnak. Ez az első bizonyíték a fehérjék elsődleges szerkezetére. 1956-ban Tjio és Levan meghatározták az emberi fajra jellemző kromoszómaszámot (2x23=46). Ugyancsak 1956-ban Kornberg kidolgozza a DNS szintézishez szükséges in vitro körülményeket. 1957-ben Crick és Gamow megfogalmazták a molekuláris biológia központi dogmáját: az egyirányú út a DNS, RNS és fehérjeszintézis között. Az DNS-ről az információ a messenger RNS irányába, majd erről a fehérje irányába történik. A dogma később módosult a reverz transzkriptáz enzim felfedezésével. Ez évben Ingram meghatározza a hemoglobin aminosav sorrendjét. 1958-ban Robert felfedezi a riboszómát, Dausset a humán HLA antigént és Sanford az egy-sejt klónozást dolgozza ki. 1959-ben kromoszómaszám változásokat fedeztek fel ismert kórképekben: 21-es triszómia-Down szindróma, 45, XO-Turner szindróma, 47, XXY-Klinefelter szindróma. 1960-ban leírják a DNS és fehérje közötti kapcsolatot, az mRNS-t. Szintén 1960-ban Krooth először mutatta ki emberi sejttenyészeten, hogy a galaktozémia egy öröklődő metabolikus anyagcserezavar. Patau leírja a 13-as és 18-as triszómiát. 1960-ban a humán kromoszómákhoz 1-22-ig terjedő sorszámot rendeltek és 7 csoportba osztották. Három évvel később a 7 csoportot A-G-ig terjedő betűjelzéssel látták el. 1966-ban Nirenberg, Mathaei és Ocho fényt derítettek a genetikai kódra. Kimutatták, hogy a 20 aminosavat 64 lehetséges triplett kombináció kódolja. 1970-ben felfedezik a reverz transzkriptázt.

1972-ben Paul Bergnek sikerült gént izolálni egy emberi rákbetegséget okozó majom vírusból. Ezt követően az izolált vírus DNS szekvenciát az E. coli lambda fágjába építette. Megalapozta a génsebészet első mérföldkövét. 1974-ben S. Anderson szekvenálja a gomba mitokondriális genomot. Létrehozzák az European Molecular Biology Laboratory (EMBL) hálózatot, amely a molekuláris biológia fejlesztését fogja szolgálni napjainkig. 1977-ben Sanger kidolgozza a DNS szekvenálás módszerét. Rekombináns DNS vizsgálatok rávilágíotanak arra, hogy tipikusan a gének nem folyamatos DNS kódoló részekből állnak, hanem nem kódoló (intron) részek vannak az információkódoló (exon) régiók között. Az exon elnevezést Gilbert vezette be 1978-ban. 1982-ben Klinger felfedezi a tumorszupreszor géneket. 1983 decemberében Mullis és Saiki kidolgozzák a polimeráz lánc-reakció (PCR) módszerét. Az 1980-as években végzett gombakísérletekkel mutatták ki, hogy a DNS-ben bekövetkező kettős szálú törések egy reparációs mechanizmust, ún. homológ rekombinációt indukálnak (a DNS kettős szálú törések egyik további alternatív reparációs mechanizmusa a nem-homológ vég-a-véghez illesztés, Non homologous end joining, NHEJ). 1986-ban klónoznak először humán géneket. 1987-ben DNS klónozás céljára használtak először élesztő mesterséges kromoszómákat. 1988-ban létrejön a National Center for Biotechnology Information (NCBI) központ. Szerepe a genomikus adatok vizsgálata és az információk gyors terjesztése. 1991-ben Craig Venter és Hamilton Smith kidolgozták a DNS szekvenálás „shotgun” stratégiáját.1989-ben egy meghatározott humán kromoszóma részét klónozták. 1990-ben kimutattak egy gént, amely meghatározóan fontos a mellrák kialakulásában. 1991-ben klónozták a cisztás fibrózis és Duchenne izomsorvadás génjét, majd 1993-ban a Huntington betegségért felelős gént. 1992-ben Mel Simon bevezeti a molekuláris klónozást bakteriális kromoszómákkal. 1994-ben elkészítették a magas felbontású humán genom fizikai térképét. 1996-ben megszületett Dolly, az első klónozott birka. 1999-ben szekvenálták az első humán kromoszómát, a 22. kromoszómát. 2000 júniusában a Humán Genom Projekt első adatai nyilvánosságra kerültek, majd 2001 februárjában publikálták az első összegzést, ezzel útjára bocsátva a genomiális érát.

Méhes Károly (1936-2007) Széchenyi díjas professzor, genetikus, gyermekgyógyász orvos és kutató megteremtette Pécsett a klinikai citogenetika és genetikai tanácsadás alapjait, illetve Magyarországon az elsők között indította útjára a humángenetikai kutatásokat. Az ő nevéhez fűződik az a megfigyelés, hogy a kromoszómák centromérái nem egyidőben válnak szét, a szétválás bizonyos szekvenciális rendet követ.

Czeizel Endre (1935-2015) Kennedy díjas, orvosgenetikus és epidemiológus professzor a genetika népszerűsítésében igen fontos szerepet válalt a XX. században. Nevéhez fűzhető legkiemelkedőbb tudományos eredménye: a folsav rendszeres, perikoncepcionális bevitele, lényegesen csökkenti a velőcsőzáródási rendellenességek (VZR) előfordulási gyakoriságát.